阿尔茨海默病研究新思路——聚焦大鼠模型

来源︱赛业生物订阅号

撰文︱Dr. Huang

编辑︱杨彬伟

导 语

阿尔茨海默病（AD）目前研究所用的动物模型主要以基因编辑小鼠为主，虽然取得了丰硕的成果，但相应的药物试验几乎全部失败，尤其是以Aβ假说为核心的药物开发，可以说是无一幸免。在这种情况下，我们是否应该稍微调整一下思路，选择另一种模型进行研究，从而以另一个视角重新审视我们的AD药物开发呢。这就将近几十年来一直处于小鼠“阴影之下”的大鼠推到了AD研究的风口浪尖，这主要得益于以下几点：

1. 大鼠整体上比小鼠更聪明，更容易训练，从而完成较复杂的实验。而这些复杂的实验对基因的改变或者药物更加敏感；

2. 大鼠没有小鼠怕人，不容易焦虑和抑郁，更适合神经生物学的行为学实验；

3. 大鼠各组织器官都比小鼠大，更容易进行手术操作；

4. AD相关基因如MAPT在大鼠中的多态性与人类更接近；

5. 日益简单的大鼠基因操作。

因此，如果我们采用大鼠作为AD的实验动物，很可能会得到小鼠实验中无法获得的信息，所以一些学者就把AD研究转移到了大鼠身上。

APP的剪切与Aβ

随着多年来对AD研究的深入，我们已经了解到AD有两大病例特征，即患者脑中会存在大量由Aβ（Amyloid Beta）聚集而成的淀粉样沉淀和由tau聚集而成的神经纤维缠结，其中Aβ由APP（Amyloid Precursor Protein）经过两次剪切而成：非淀粉样蛋白剪切和淀粉样蛋白剪切。前者可以理解为不产生毒性Aβ的“好的”剪切方式，后者过度活跃则会造成Aβ过载，产生淀粉样沉淀。这两种剪切都需要两把“剪刀”，区别在于第一把“剪刀”的不同，前者第一刀是α-secretase（α剪切酶）动的手，因为α剪切酶几乎是从APP的Aβ片段中间拦腰剪断的，所以Aβ——卒！但要注意的是，这种剪切之后APP就裂开了，形成了N端的APPSα（也可以写成sAPPα）和C端的α-CTF，可以简单地理解成，这两个片段越多，说明APP的剪切越趋近于“良性”，越不容易产生Aβ。至于α-CTF的进一步剪切，我们暂时不用管它。

如果是淀粉样蛋白剪切，那就是β-secretase（β剪切酶）开始动的手。这一刀剪在Aβ序列的N端，APP就分成了APPSβ（也可以写成sAPPβ）和C端的β-CTF，刚才说到的Swe突变就会导致APP的β剪切更容易发生。这些带“β”家伙的出现往往就意味着Aβ含量的增加，因为β-CTF再被γ剪切酶剪切后“大魔王”Aβ就正式出场了。

图1. APP剪切过程

这里顺道提一下，γ剪切酶与α和β剪切酶不一样，后面两个刀法精准，剪切位置固定；而γ则对α-CTF或者β-CTF的剪切飘忽不定，所以Aβ指的是一类短肽（36-43个氨基酸都有可能），而不是固定大小的片段，总体而言Aβ越长，越容易聚集，毒性也就越大。

Aβ人源化突变大鼠

因为只有人类和一些灵长类动物的Aβ片段是容易发生聚集的，如果不将Aβ片段人源化，即使在啮齿类动物中引入再多的突变，也很难产生Aβ聚集物，从而影响造模效果，因此构建大鼠模型需要将Aβ片段人源化。接着对Aβ人源化了的大鼠进行突变，接下来为大家介绍3种Aβ人源化突变大鼠。

Luciano D’Adamio实验室发表了三种AD基因编辑大鼠，这三种大鼠均采用基因敲入（Knock-In）的方法。有人可能会问，为什么选用KI而非传统转基因（Transgenic，Tg）的方式呢，这一方面是由于过往采用转基因方式的研究没有产出一款AD治疗药物（基于Aβ假说）；另一方面KI相较于Tg有以下三大优势：

1. 和Tg相比，KI没有随机插入，对大鼠本身基因的影响控制到了最低水平；

2. 没有多拷贝，更接近人类疾病中的病理特征；

3. 保留了大部分大鼠基因的原有序列，使得大鼠原有的调控原件仍能发挥作用。

图2. 三种APP基因编辑大鼠

作者分别对Aβ人源化了的大鼠进行了两种突变，一种是常见的Swe突变，即K670N/M671L突变，这种突变会造成家族性AD的发生，使病患产生认知障碍；而另一种则是A673T突变，这种突变会对AD产生的认知障碍有一定的保护作用。

Luciano D’Adamio实验室制作了PS1突变敲入的大鼠，同时具有人源化的Aβ序列和L435F的纯合突变。

图3. PS1的L435F突变位点

Aβ人源化＋A673T突变大鼠

先来解释下图中的各种大鼠的名称，w/w是野生型，δ7/δ7是删除了7个碱基片段的APP，h/h是人源化Aβ纯合，s/s是在人源化基础上进行swe突变纯合子，p/p是在人源化基础上A673T突变纯合子。在第21天时，三种人源化大鼠的APP表达没有改变。

而p/p的sAPPα水平却明显高于h/h，而sAPPβ则低于h/h，这说明大鼠的A673T突变抑制了β剪切酶的剪切。同时，β-CTF也相应减少。这说明A673T突变在该大鼠21日龄时在APP的剪切层面具有一定的保护作用，也就是抑制β剪切酶对APP进行剪切。

图4.A673T突变抑制β剪切酶的剪切作用

除了抑制β剪切酶的功能以外，理论上，由于β-CTF减少，Aβ的表达应该也受到抑制，结果不出所料，28天的大鼠各种Aβ显著降低，值得注意的是，这里的研究还对大鼠进行了雌性区分，结果基本类似。WB对CTF的检测得到的结果也与N端产物类似，这说明A673T突变能抑制Aβ的产生。比较有意思的是在Aβ38的检测中，该Aβ只在雌性小鼠中存在。

图5. A673T突变抑制Aβ生成

Aβ人源化＋swe突变大鼠

反过来，如果是APPswe大鼠，则会有明显的β剪切和Aβ表达的增加，同时由于β剪切的加剧，成熟APP的含量也降低。因此该大鼠模型在APP剪切方面对AD进行了有效的模拟。

总结起来就是保护性的A673T突变会降低β剪切，而swe突变会增加β剪切。前者最终降低Aβ，而后者则增加Aβ。

图6. swe突变增加Aβ

Aβ人源化＋PS1突变大鼠

图1中γ剪切酶由4种蛋白共同组成，其中最重要的组成元素就是早老素蛋白1（Presenlin1，PS1）了。Luciano D’Adamio实验室制作了PS1突变敲入的大鼠。

该大鼠可以表达L435F突变，这与小鼠不同，如果小鼠含有这种PS1上的纯合突变是致死的，无法进行后续的实验。而纯合L435F大鼠虽然也会造成27天时体重的下降以及1月龄时40%的死亡率，但挺过一个月的大鼠活到2月龄基本没有问题，所以L435F纯合大鼠是可以进行实验的。此外438位点的突变是同义突变，对氨基酸序列没有影响。

图7. PS1纯合突变降低大鼠体重和生存率

有意思的是，大鼠出生4天后就会造成Aβ38、Aβ40和Aβ42的降低，但却会造成Aβ43的增加。同时高分子量Aβ与低分子量Aβ之比也会随着突变的影响而增大，因此这个结果说明PS1-L435F KI降低了γ剪切酶的整体剪切能力，但提升了对Aβ43的剪切。Aβ的毒性不仅与Aβ的丰度有关，也与不同Aβ之间的比值相关，因此这个结论究竟对Aβ的毒性有怎样的影响，还有待于进一步研究；另一方面，由于使用的大鼠刚出生4天，所以随着年龄的增加γ剪切酶的功能会不会发生改变还犹未可知。

图8. PS1的L435F突变增加Aβ43

综上，其实我们已经有了具有AD病理特征的大鼠KI模型，而且随着基因编辑技术在大鼠中的应用愈发成熟，我们也可以将人的更多突变引入到大鼠中，从而模拟人的AD病理表型。目前AD大鼠模型的数量相对而言还很少，但大鼠在AD研究甚至神经生物学研究中的优势让人不得不重新对其重视起来。

不过稍微让人感到遗憾的是，由于上面提到的AD大鼠模型在进行病理实验时年龄还太小（最大的实验年龄也才28天，最小才4天），因此很多分子层面的改变可能需要时间的积累才能发生。此外，神经生物学中最重要的行为表型也需要在一定年龄后进行检测，这将是模型优劣的关键。因此十分期待后续的行为研究能有不错的结果。

由于大鼠相对小鼠更为聪明，行为实验中的分辨率会进一步提高，我们已有的分子和病理层面的改变更容易反应到行为上来。

此外在已经构建了不同基因编辑模型的情况下，如果将这些大鼠进行杂交，也可以获得如Tg小鼠的多基因编辑大鼠，从而有利于我们获得更明显的病理表型。因此大鼠模型的建立，开发和优化将为AD的研究，尤其是药物开发研究提供有力的武器。

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参考文献（上下滑动阅读） 

1.Tambini M D , D'Adamio L . Knock-in rats with homozygous PSEN1 L435F Alzheimer mutation are viable and show selective γ-secretase activity loss causing low Aβ40/42, high Aβ43[J]. Journal of Biological Chemistry, 2020:jbc.RA120.012542.

2. Tambini M D , Norris K A , D'Adamio L . Opposite changes in APP processing and human Aβ levels in rats carrying either a protective or a pathogenic APP mutation[J].eLife Sciences, 2020, 9.

本文完